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蛍光プローブを用いた胚性幹細胞由来細胞の特性識別 コラム｜未来を創造するサイエンス

蛍光プローブを用いた胚性幹細胞由来細胞の注目すべき実例

Written by Patricia Viard, PhD

幹細胞研究における課題の１つは、様々な異種混合培養細胞の亜母集団をどのように同定し分類するかということです。実際、着床前胚（ESCs）の内細胞塊[1;2]や再プログラム化された体細胞（人工多能性SCs/iPSCs）[3;4;5]から直接得られた幹細胞（SCs）は、様々な中間段階を持つプライム型あるいはナイーブ型いずれかの主として2つの多能性状態を持っています[6;7]。この優れた自己再性能については、ナイーブ型SCsは適切なきっかけを受ければ分化したいどのような細胞型にも成れるより優れた能力があります[7;8]。その反面、分化プロセスの効率やタイミングについては細胞間で大きな変動性があり、目的とする表現形質に成り細胞ベース治療や創薬研究に使われるのは、SCsのほんの僅かだけです[9]。更には分化に失敗したSCsは潜在的に催奇性を有すこともあり、正確な細胞の選別は臨床応用における安全性の確保に非常に重要な原則となります[10]。これ故に、ナイーブ型SCsを単離し、次いでインビトロ分化させた後、目的のSC由来細胞を単離する信頼できる技術が重要になってきます。

SC選別についての著名な研究には、組換え動物モデルに蛍光レポーター遺伝子を発現させる方法が見受けられます[3;7;11]。しかし、組換え技術を行うことに由来する内因性のバイアスが課題になります。これらが発現した場合、細胞の正常の機能としての内在性タンパクと競合したりパートナー因子やレギュレーター因子との相互作用が阻害されたりします。更には、ゲノムDNAにランダムに挿入される導入遺伝子が内在性遺伝子のレギュレーションや全体性に取って代わる可能性があります。その代替方法として、生きたままの細胞の細胞型を選別できる、細胞表面マーカーを免疫検出する方法が使われるようになってきました[12;13;14]。しかし免疫検出ラベリングを簡単に取り外すことができません。どちらにせよ、これらのどの方法もヒト治療法には適切ではないのです。こういう訳で、最近では多様性や分化能の内在性マーカーを検出する、非侵襲的方法への興味が急増してきています。多能性SCsや分化した細胞を選別する様々な種類の蛍光プローブが開発されています。注目すべき実例を下記に紹介します。

独特な多能性状態にある幹細胞の単離

SCsの多様性を評価するために様々な蛍光低分子がDOFLA（Diversity Oriented Fluorescence Library Approach）によって化学合成されました[15]。そのようなプローブの内の1つであるCDy1（Compound of Destination yellow1）はローザミンベースの色素でありマウスESCsとiPSCsを選択的にラベルします[16;17]。驚くべきことに、このCDy1のオレンジ/レッド蛍光（励起波長535nm、検出波長570nm）はマウスiPSCsの転写因子Oct4–GFPの発現より前に検出されることです[17]。この結果は、標準的な多様性マーカーの発現に先立って、CDy1が多様性初期状態の選別に利用できることを示唆しています。更には、CDy1は従来分化しなかったSCsの標的化と除去にも使われていたので[18]、幹細胞治療に関連して発生する催奇性のリスクを防ぐためにも活用できます[19]。

Discriminating between specific cell types derived from embryonic stem cells using fluorescent probes

その他の赤色蛍光プローブでは、ローダミンKyotoプローブ1（KP–1）がヒトiPSCsを選択的に染色します[20]。分化された細胞では、KP–1はATP Binding Cassette（ABC）トランスポーターによって細胞外に活発に放出されることで、染色がなされません。これらのトランスポーターの発現はヒトiPSCsだけでなくがん細胞においても抑制されます。それ故にKP–1は子宮がんセルラインであるHeLa細胞も染色します[20]。このようにKP–1は多様性のマーカーですが、幹細胞の特異的マーカーではありません。

後々の研究によってCho氏とその共同研究等は別の化合物CDy9がマウスESCsプライム型に対するナイーブ型を特異的にラベルすることを明らかにしました[21;22]。CDy9はナイーブ型マウスESCsに高発現している細胞膜トランスポーターSlc（Solute Carrier）13a5を介して細胞内に侵入します[22]。CDy9は合成オレンジ/レッドBODIPY中間体に由来します。その蛍光特性はCDy1と若干異なっており最大励起波長と検出波長がそれぞれ563nmと578nmになっています。1μM CDy9溶液で1時間培養した後、CDy9陽性細胞を蛍光活性化細胞選別装置（FACS）で分別しました[22]。免疫ラベリングをおこなわず、プライム型状態の従来からの表面マーカーであったSSEA–4（StageSpecific幹細胞抗原）によって確認できたように、この方法ではナイーブ型の多様性細胞を特異的に単離することができます。

SCs由来細胞の分化細胞選別

よく報告されている例としては、インドシアニングリーン（ICG）による肝細胞様細胞の検出があります。ICGは無毒性の陰イオン性蛍光性有機化合物で選択的に肝細胞に結合するので、しばしば肝機能評価の臨床検査に使われています[23;24]。Yoshie氏とその共同研究者等の報告によれば[25]、マウスR1セルライン由来のESCsから肝細胞様細胞が分化されています。5μg/ml ICGにて30分間培養し、分化された細胞をICG陽性細胞を検出するために、FISHMAN–Rフローサイトメーター（On–Chip technologies社）にて、励起レーザー波長785nm、バンドパスフィルター815-850nmの条件で解析されました。著者らはマウスESC由来肝細胞様細胞が選択的にICGと結合することを示しています。肝細胞表現型は、過ヨウ素酸シッフ染色法とリアルタイムPCRとによる肝細胞特異的遺伝子転写の定量的分析によって確認されています。このフローサイトメトリー方法によって、筆者らはICGが特異的にラット初代肝細胞とヒト肝細胞癌細胞（HepG2）とを染色することも明らかにしています。それとは逆に、肝細胞セルライン以外のラット膵臓腺がん（AR42J）、ヒト乳腺がん（MCF7）、そしてヒト胚性腎細胞T（HEK293T）などでは、これらの実験条件下では原則的に非標識のままとなっています。注目すべきは、ICGの蛍光特性が高濃度域では変えられていることです。これはつまり、解析はICGが肝細胞へ集積しない様に、また非特異的なラベリングが起こらない様に、低濃度でかつ短い培養時間で行うことが推奨されています。

その他の蛍光プローブと性能

Discriminating between specific cell types derived from embryonic stem cells

肝細胞由来の特異的な細胞を識別するのに有用なプローブは、ICG以外には数えるほどしかありません。それらの中でもBODIPY派生化合物であるCDr3（Compound of Designation Red 3）は特異的にマウスとヒトの神経肝細胞を認識します[26]。CDr3は神経細胞の細胞質に高発現する脂肪酸結合タンパク7（FABP7）と結合します。他の遺伝子操作を伴わない取り組みは、侵襲的ではありますが、考慮する価値は十分あります。例えば分子ビーコン（MB）と呼ばれる方法は、心室心筋特異的転写因子[28]である転写コード化Irx4（Iroquois Homeobox Protein4）のような細胞型特異的mRNAsと結合した際に蛍光を発するようになっています[27]。蛍光標識化オリゴヌクレオチド（Cy3ラベル）を移送するナノ粒子によって多様性マーカーを検出した報告もあります[29]。

それでもなお、目的の細胞を特異的に検出するように設計された蛍光色素は極めて少なく、ほとんどは動物モデルによって評価されています。ヒト幹細胞から分化される細胞型の種類が増加するに伴い、侵襲的ではないヒト細胞特異的内在性マーカーの検出技術の要求が高まってきています。細胞分別方法は工程全体を通して短い培養時間であることと滅菌環境が保たれること、そして細胞の完全性が保たれることが重要になります。これらの要求はSC由来細胞を再生医療分野に応用するに当たって安全性の確保は本質的な課題となってきます。

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